Comisionados

Imagen: Recorriendo la pampa desde Rosario hasta Bahía Blanca

La Dra. Silvina Pessino (IICAR-CONICET, Argentina) fue destacada a la UMIL, Italia, del 2 de octubre al 27 de noviembre de 2024, para investigar el papel de varios FACTORES RESPONSABLES A LA AUXINA (ARFs) y sus respectivos controladores miRNA en la especificación de la línea germinal femenina en Arabidopsis thaliana, en colaboración con la Dra. Lucia Colombo y la Dra. Marta Mendes. En particular, durante esta comisión de servicio, participó en los pasos finales de publicación del artículo Pessino SC et al. (2024) AUXIN RESPONSIVE FACTOR 10 insensitive to miR160 regulation induces apospory-like phenotypes in Arabidopsis. iScience; preparó varios entregables del proyecto MAD y analizó datos McSeED y RNA-seq que apuntan al control de la expresión de ARF mediado por el sistema RdDM.

Imagen: Marta Mendes (izquierda) & Silvina Pessino (derecha)

El Dr. Juan Pablo A. Ortiz realizará una nueva comisión de servicio para el análisis de secuencias relacionadas con la apomixis, con especial atención en el descubrimiento de genes asociados a la partenogénesis. El trabajo incluirá el análisis de las bases de datos transcriptómicos de genotipos sexuales y apomícticos para identificar genes relacionados con cascadas hormonales, procesamiento de ARN y señalización celular que puedan estar implicados en la partenogénesis. El análisis también incluirá los recursos genómicos de locus controlador de la apomixis ya disponibles. Este trabajo se llevará a cabo en colaboración con el Dr. Giovanni Gabelli del grupo DAFNAE. Los resultados obtenidos contribuirán al WP3 y WP4 y pueden aportar nuevos candidatos de la inducción de la partenogénesis en especies apomícticas naturales.

Foto: Tomando maté… de izquierda a derecha: Juan Pablo Ortiz, Lorena Siena & Samela Draga

El objetivo de esta comisión de servicio es profundizar la caracterización de los genomas sexual y apomíctico de Paspalum simplex. El plan de trabajo incluye la extracción de ADN, la preparación de bibliotecas y los experimentos de secuenciación de genotipos tetraploides utilizando la tecnología ONT. Estas actividades contribuirán al WP3 cuyo objetivo es analizar la estructura y evolución de los genomas apomícticos y dilucidar el contenido génico y la función del locus de la apomixis. Los otros miembros del equipo que participarán en este trabajo son la Dra. Lorena Siena (IICAR), el Dr. Andrea Rubini (IBBR) y el BSc Davide Perrone (IBBR). Como parte de la visita, Juan Pablo también trabajará en la construcción de un vector plasmídico de ARNi diseñado para regular a la baja el gen ORC3, uno de los candidatos identificados por el grupo del Dr. Pupilli en el IBBR como el principal regulador del desarrollo del endosperma en semillas apomícticas. La construcción del ARNi se utilizará para generar plantas transgénicas de maíz, como parte de una estrategia para validar su efecto en la formación de semillas con exceso de genoma materno en plantas sexuales. Esta parte del trabajo se realizará en colaboración con la Dra. Francesca De Marchis y el Dr. Michelle Bellucci, del IBBR.

Imagen: Juan Pablo A. Ortiz (izquierda) & Fulvio Pupilli (derecha)

Se generaron plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana expresando genes relacionados con la apomixis y identificados en Eragrostis curvula. Estas plantas muestran varios fenotipos relacionados con la apomixis durante la especificación de la CMM y el desarrollo del saco embrionario, así como signos de pérdida de metilación del ADN. El objetivo de este trabajo es caracterizar las marcas histónicas más relevantes durante el desarrollo del óvulo en estas líneas transgénicas de Arabidopsis mediante técnicas de inmunomarcaje y microscopía confocal. 

​

El objetivo de esta comisión de servicio era iniciar la caracterización de líneas mutantes SALK en Arabidopsis thaliana para los genes CHC2 (Clathrin heavy chain 2) y NFD3 (Nuclear fusion defective 3), ambos identificados previamente como expresados diferencialmente en genotipos apomícticos y sexuales de Eragrostis curvula. Se llevó a cabo el genotipado con cebadores específicos y actualmente se están estudiando varias de las líneas heterocigóticas identificadas. También hemos obtenido plantas mutadas mediante CRISPR-Cas9 para el gen SPL7 (Squamosa promoter binding like 7). Actualmente se están caracterizando. Además, se llevó a cabo una hibridación in situ (ISH) para determinar el perfil de expresión del gen SPL7 en los tejidos reproductivos de individuos diploides y tetraploides de A. thaliana (ecotipo Col0).

El objetivo principal de esta comisión de servico es continuar con la caracterización de una población segregante para la apomixis en Eragrostis curvula con el fin de generar un mapa de ligamiento y seleccionar individuos con marcadores moleculares similares pero diferentes modo reproductivo (apomíctica y sexual) para futuros análisis transcriptómicos. Durante estos dos meses, en colaboración con el grupo UNIPG, se plantea continuar el análisis de los datos fenotípicos y genoticos de una población de mapeo de E. curvula para genenerar un nuevo mapa consenso e identificar marcadores moleculares relacionados con la apomeiosis y, en última instancia, descubrir genes que podrían desempeñar un papel en el control de la reproducción apomíctica. Además, también contribuiré a la elaboración de un calendario destinado a asociar parámetros morfológicos florales con las fases de desarrollo de la megasporogénesis y la megagametogénesis para diferentes genotipos apomícticos y sexuales en E. curvula (Tarea 3.3).

El objetivo general de la visita de Samela Draga al laboratorio del Prof. Pessino del 3 de noviembre de 2023 al 18 de enero de 2024 es continuar el proyecto iniciado en marzo-julio de 2023 en el IICAR-CONICET-UNR, cuyo objetivo es comprender el papel del factor de splicing BUD13 (un interactor de TGS1) en plantas apomícticas y sexuales de Paspalum. BUD13 se expresa de forma diferencial en las flores de plantas sexuales y apomícticas en al menos dos especies apospóricas, Paspalum notatum e Hypericum perforatum. Curiosamente, los mutantes de bud13 en Arabidopsis están asociados a defectos en el desarrollo embrionario temprano. Durante su visita, Samela producirá una sonda BUD13 marcada con digoxigenina, preparará secciones de ovarios embebidos en bloques de parafina y realizará análisis ISH. Las observaciones permitirán determinar los perfiles de expresión espacial de BUD13 en los órganos reproductores de los genotipos sexual y apomíctico de Paspalum notatum.

Durante su primera comisión de servicio en Rosario, del 9 de noviembre al 14 de diciembre de 2023, Fulvio Pupilli discutió con Juan Pablo Ortiz, su equipo y Olivier Leblanc los recientes avances en secuenciación Nanopore y el ensamblaje de genomas apomícticos y sexuales en Paspalum simplex. Además, se discutieron con JP Ortiz los progresos realizados en la caracterización del gen PsARF5, que se expresa de forma diferencial entre los tejidos nucelares disecados por LCM de genotipos apomícticos y sexuales, así como las posibles interacciones con PnIAA30, un gen que actualmente se está caracterizando funcionalmente en el IICAR. Para la próxima comisión de servicio se ha programado una serie de experimentos de hibridación in situ para PsARF5. Por último, ha preparado una presentación sobre el papel del gen PsORC3 en el desarrollo del albumen con exceso genómico materno en P. simplex y un homenaje al profesor Camilo Luis Quarin para el IV congreso Apomixis, que se celebrará del 3 al 7 de diciembre de 2023 en Rosario, Argentina.

Durante esta comisión de servicio, seguimos trabajando en Paspalum rufum con Luciana Delgado.  Para comprender las interrelaciones entre la arquitectura del primordio del óvulo y la plasticidad del destino celular que conduce a la aposporía, estamos realizando un análisis morfométrico celular en 3D de genotipos de P. rufum que muestran una expresividad diferencial de la aposporía. El primer paso es construir un atlas 3D de referencia del genotipo sexual. Tras el trabajo de segmentación, etiquetado y exportación de datos realizado en las sesiones anteriores mediante el software MorphographX (MGX), nos dispusimos a realizar un análisis cuantitativo en un grupo piloto de 11 óvulos en estadios sucesivos que cubrían la ventana de desarrollo de interés. Además de la cuantificación del número y tamaño de las células, se seleccionaron diferentes descriptores de forma, tanto a nivel celular como de órgano, y se calcularon a partir de las características extraídas por MGX. Dado que los datos piloto ya abarcan miles de células para analizar, se escribieron scripts personalizados en R para gestionar la compilación de datos, la visualización y el análisis estadístico. Además, se diseccionaron, fijaron y limpiaron óvulos de P.rufum en torno a la fase de meiosis, para ampliar la ventana de desarrollo cubierta y maximizar la probabilidad de detección de crecimiento celular diferencial entre genotipos sexuales y apospóricos.

Paspalum rufum, Luciana Delgado & Daphné Autran

​

Davide Perrone está visitando el IICAR-CONICET para continuar los experimentos iniciados durante una comisión de servicio anterior, relativos a la transformación de plantas apomícticas y sexuales de Paspalum notatum con reporteros fluorescentes de auxina y citoquinina. El objetivo de estos experimentos es comparar la distribución de hormonas en los óvulos de plantas sexuales y apomícticas. Además, Davide iniciará experimentos de hibridación in situ destinados a comparar la expresión del gen AUXIN RESPONSE FACTOR 10 (ARF10) en los óvulos de los biotipos de biotipos sexuales y apomícticos de Paspalum notatum. Por último, en colaboración con científicos del IICAR, llevará a cabo análisis miR-seq utilizando datos generados previamente en Milán.

Foto (de izquierda a derecha): Augustus Villalba (IBONE), Silvina Pessino (IICAR), Maricel Podio (IICAR) & Davide Perrone (Univ. Milán)

Francesca De Marchis es investigadora del Consejo Nacional de Investigación, CNR- IBBR – Perugia. Durante su visita,  trabajará con el Dr. Juan Pablo A. Ortiz del IICAR – CONICET (Rosario, Argentina) y su experiencia en biotecnología vegetal será aprovechada para diseñar un vector para la transformación de Paspalum notatum. Algunos genes candidatos para la partenogénesis, identificados por el grupo de investigación del IICAR, serán considerados para la transformación de plantas mediante tecnología biolística eligiendo la sobreexpresión o la represión.

El objetivo de mi comisión de servicio en el NIAB era continuar con el trabajo iniciado con el grupo del Dr. Caccamo relacionado con la identificación y caracterización de una región genómica y de genes implicados en la apomixis. Aquí discutimos estrategias y diseñamos nuevos experimentos. El trabajo en curso consiste en la secuenciación y ensamblaje del genoma del cultivar apomíctico Don Walter (Eragrostis curvula). Este genoma fue secuenciado en el NIAB usando la plataforma Oxford nanopore con el protocolo de modelo de planta de super-alta precisión y uno de los estudiantes del CERZOS está trabajando aquí haciendo el ensamblaje. También estamos involucrados en un proyecto de transcriptómica utilizando datos de RNA-seq obtenidos de tejidos de pistilo de plantas apomícticas y sexuales en tres etapas de desarrollo diferentes. Estamos buscando genes expresados diferencialmente entre plantas con diferentes modos reproductivos y diferentes estados de desarrollo.

Foto: Viviana en The Eagle, Cambridge (Inglaterra)

En un nuevo secondment, Lorena Siena, del IICAR, está visitando el IRD por tres meses. El objetivo de la visita es avanzar en la caracterización funcional de los genes TGS1 y QGJ durante el desarrollo reproductivo de Arabidopsis thaliana. Las actividades se llevarán a cabo en colaboración con el grupo del IRD y, en primer lugar, incluyen el análisis del potencial de embriones partenogenéticos en líneas mutantes tgs1 mediante el uso de reporteros fluorescentes específicos de embrión transmitidos maternal y paternalmente. Además, se caracterizará ampliamente la identidad celular de las megasporas adicionales y funcionales observadas en los óvulos qgj, por ejemplo utilizando el reportero pWOX2-CENH3-GFP. Por otra parte, iniciaremos experimentos destinados a identificar posibles interacciones entre QGJ y TGS1 determinando el patrón de expresión de QGJ (pQGJ-GUS) en óvulos tgs1 y, recíprocamente, el de TGS1 (pTGS1:TGS1-GUS) en óvulos qgj.

Imagen: Aquaducto de Montpellier (@ Lorena Siena, IICAR)

El objetivo de esta estancia en el CERZOS era profundizar mi conocimiento, habilidades y experiencia práctica en el área de la hibridación in situ y la microscopía DIC en plantas.

El objetivo general del trabajo de Samela en IICAR es contribuir a la elucidación del papel de la proteína de splicing BUD13 en la transición sexualidad-apomixis. En particular, caracterizará BUD13 en las bases de datos transcriptómicas y genómicas de Paspalum notatum y generará sondas para su detección mediante hibridación in situ de ARN. Además, clasificará los óvulos de plantas sexuales y apomícticas de Paspalum notatum según las etapas de desarrollo mediante citoembriología DIC, los deshidratará en una serie de etanol/xilol y los incluirá en parafina. En una segunda visita (octubre-diciembre), preparará secciones de óvulos para hibridarlos con sondas de ARN sentido y antisentido marcadas con digoxigenina y detectará la señal DIG mediante reacción colorimétrica (anticuerpo DIG conjugado con fosfasa alcalina, sustratos NBT/BCIP).  Esperamos obtener información sobre la expresión espacial de estos genes candidatos en genotipos apomícticos y sexuales.

Samela Draga (derecha) & Silvina Pessino (izquierda)

Durante mi comisión de servicio en la Universidad de Adelaida (laboratorio de Matthew Tucker) mi trabajo se centrará en desentrañar los mecanismos moleculares que determinan una correcta progresión de la línea germinal femenina en Arabidopsis thaliana. En particular, intentaré caracterizar los principales actores implicados en la degeneración de las esporas y en la selección y diferenciación funcional de las megasporas al final de la megasporogénesis en el óvulo. Determinaré la contribución de la interacción fitohormonal intentando rescatar mutantes defectuosos en estos procesos clave utilizando regiones reguladoras específicas activas en diferentes dominios del óvulo para dirigir específicamente la expresión de genes candidatos.

de izquierda a derecha : Nicola Babolin, Skippy el canguro, Rosanna Petrella

El pasado 7 de marzo de 2023 se inició una nueva estancia del Dr. Juan Pablo A. Ortiz del IICAR en el IRD, en el marco de una comisión de servicio del MAD para caracterizar los genomas apomícticos (WP3). El plan de trabajo incluye la extracción de ADN de varias muestras de Paspalum spp para su secuenciación con Illumina y el análisis estructural del genoma. La visita también está dedicada a la preparación de un nuevo manuscrito que describe la secuenciación, el ensamblaje con resolución a nivel cromosómico y la anotación del genoma diploide de Paspalum notatum. Este resultado, fruto de un esfuerzo de colaboración entre diferentes socios argentinos, italianos y franceses del proyecto MAD, es un paso clave para el progreso del WP3 ya que servirá de referencia para caracterizar los genomas tetraploides y determinar la estructura y evolución de la región implicada en la apomixis. Por último, durante esta visita se discutirá y decidirá el programa del taller internacional sobre secuenciación por ONT y análisis bioinformático organizado por el proyecto MAD en Rosario, Argentina, para el próximo mes de noviembre.

Invernaderos del IRD. Juan Pablo A Ortiz (derecha) & Olivier Leblanc (izquierda)

El objetivo de esta comisión de servicio era analizar los genes que muestran una expresión diferencial entre óvulos de plantas sexuales y apomícticas de Eragrostis curvula y que también están presentes en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Para ello, estudiamos el fenotipo de mutantes de A. thaliana disponibles públicamente para algunos de estos genes, pero también el de nuevas líneas mutantes transgénicas generadas mediante la estrategia CRISPR-Cas9. Además, se caracterizó el desarrollo de los óvulos en genotipos apomícticos y sexuales de E. curvula mediante microscopía confocal, con el fin de conocer mejor las estructuras y las diferencias entre los modos de reproducción sexual y asexual.

de izquierda a derecha: Marta Mendes, Lucia Colombo, Alejandra Díaz y Cielo Pasten

Davide Perrone (Universidad de Milán, Italia) está visitando el laboratorio de la Prof. Silvina Pessino en el IICAR CONICET, Rosario, Argentina, del 3 de septiembre al 27 de noviembre de 2022. Su trabajo, realizado en colaboración con la Dra. Carolina Colono (IICAR-CONICET-UNR), tiene como objetivo utilizar la transformación biolística para producir líneas fluorescentes de Paspalum notatum DR5 (marcador de auxina) y TCS (marcador de citoquinina) con diferentes modos reproductivos (sexualidad y apomixis aposporosa). Estos materiales vegetales serán útiles para estudiar los patrones hormonales en diferentes etapas de desarrollo del ovulo en un modelo apomíctico bien caracterizado. Además, Davide está contribuyendo a estudiar el papel del FACTOR DE RESPUESTA A LA AUXINA 10 (ARF10) en el transporte de la auxina dentro del óvulo de Arabidopsis, realizando caracterizaciones citoembriológicas de cruzas arf10 x PIN1 y arf10 x DII-Venus obtenidos previamente en el IICAR-CONICET-UNR. Finalmente, está involucrado en el análisis de la conexión funcional entre el FACTOR DE RESPUESTA A LA AUXINA 10 (ARF10) y la TRIMETHYL GUANOSINE SYNTHASE (TGS1) (un controlador de la aposporía reportado) en Paspalum.

de izquierda a derecha: Carolina Colono, Silvina Pessino, Davide Perrone

Una nueva comisión de servicio del MAD dirigida a trabajar en la caracterización de genomas apomícticos (WP3) comenzó el 7 de junio de 2022. En esta ocasión, el Dr. Juan Pablo A. Ortiz del IICAR (CONICET-UNR, Argentina) está visitando el laboratorio del Dr. Olivier Leblanc en el IRD (Francia). El plan de trabajo incluye la anotación de un ensamblaje del genoma de un ecotipo diploide de bahía de Pensacola (Paspalum notatum, var. saurae Parodi), obtenido previamente en una colaboración entre laboratorios de Francia, Italia y Argentina. También pretendemos identificar y caracterizar secuencias relacionadas con el locus controlador de la apomixis (ACL) en una raza tetraploide. En particular, utilizaremos la tecnología ONT de «secuenciación adaptativa» que permite la secuenciación de regiones de interés. Por lo tanto, esperamos enriquecer nuestra secuenciación con lecturas específicas de la planta apomíctica tetraploide y luego ensamblar el ACL. Olivier Leblanc, Cédric Mariac y Julie Orjuela (Unidad de investigación del DIADE), así como Juan Manuel Vega (MAD adscrito al IICAR) contribuirán a este trabajo.

Juan Pablo Ortiz (izquierda) & Olivier Leblanc (derecha)

En esta comisión de servicio, la Dra. Luciana Delgado (IICAR) y la Dra. Daphné Autran trabajan juntas para estudiar la comunicación entre la división, la expansión y la diferenciación celular a lo largo del desarrollo reproductivo femenino en P. rufum, una especie apomíctica. El objetivo general es construir un atlas 3D del desarrollo temprano del óvulo. Durante la estancia estableceremos las condiciones óptimas para la clarificación de los óvulos de P. rufum y las técnicas de tinción de la pared celular para obtener imágenes 3D de alta resolución. Las imágenes se segmentarán con MorphoGraphX, se clasificarán por etapas de desarrollo y, finalmente, se realizará un análisis cuantitativo de descriptores celulares. Creemos que la comprensión de la coordinación entre los procesos de desarrollo reproductivo con el crecimiento y la división celular, en un contexto apomíctico, podría ser esclarecedora para entender la regulación de la apomixis.

Daphné Autran (izquierda) & Luciana Delgado (derecha)

El 9 de mayo comienza una nueva comisión de servicio del MAD de un mes de duración en la que participan investigadores de Argentina e Italia. En efecto, el Dr. Juan Pablo A. Ortiz del IICAR, (CONICET-UNR) está visitando el laboratorio del Dr. Fulvio Pupilli en el Instituto de Biociencias y Biorecursos (IBBR-CNR) de Perugia. El plan de trabajo se centra en el análisis funcional de ORC3, un gen que se segrega completamente ligado a la apomixis, en la formación del endospermo de semillas apomícticas de Paspalum simplex. Además, también se pretende avanzar en el ensamblaje y la caracterización del genoma de P. simplex utilizando lecturas de secuencias largas generadas con la tecnología Oxford Nanopore. Los miembros del grupo del Dr. Pupilli que participan en este proyecto son: Dra. María Eugenia Cáceres, Dr. Andrea Rubini, Dra. Francesca De Marchis y Dr. Michele Bellucci. Al final de la comisión de servicio, se espera haber completado la redacción de un manuscrito sobre el análisis funcional de PsORC3 y producido un borrador del ensamblaje del genoma de P. simplex.

Fulvio Pupilli (izquierda) & Juan Pablo A. Ortiz (derecha)

Esta comisión de servicio forma parte del esfuerzo emprendido por el proyecto MAD (ver objetivos del WP3) para determinar la naturaleza, la evolución y el papel funcional de la región de control de la aposporía (ACR) en Paspalum notatum. Aprovechando un genoma diploide de referencia y conjuntos de datos de lecturas largas disponibles para apomícticos tetraploides, primero utilizaré el método “adaptative sampling” que ofrece la plataforma ONT para enriquecer la secuenciación de lecturas largas de ACR y luego realizaré un ensamblaje de alta cobertura tanto para un apomíctico obligado como para un apomíctico facultativo. También se aplicarán estudios complementarios mediante el uso de métodos open source destinados a identificar y filtrar las variaciones estructurales.  En conjunto, esto debería permitir estudios de genómica estructural y comparativa para determinar el contenido genico y la capacidad de codificación/regulación dentro del ACR y proporcionar pistas sobre su papel funcional en la aparición de la apomixis en Paspalum.