Personnel détaché

Ce nouveau détachement de Juan Pablo A. Ortiz a pour objectif d’analyser des séquences liées à l’apomixie, avec un accent particulier sur la découverte de gènes associés à la parthénogenèse. Ce travail comprendra l’analyse de bases de données transcriptomiques de génotypes sexués et apomictiques afin d’identifier les gènes qui participent aux cascades de réactions hormonales, aux différentes étapes  de traitement de l’ARN et à la signalisation cellulaire. L’analyse inclura également les ressources génomiques disponibles sur les locus de contrôle de l’apomixie disponibles pour différentes plantes apomictiques. Ce travail sera réalisé en collaboration avec le Dr Giovanni Gabelli du groupe DAFNAE. Les résultats obtenus contribueront aux WP3 et WP4 et pourraient fournir de nouveaux candidats pour l’induction de la parthénogenèse chez les espèces apomictiques naturelles.

Photo: Partage du maté… de gauche à droite: Juan Pablo Ortiz, Lorena Siena & Samela Draga

L’objectif de ce détachement est d’approfondir la caractérisation des génomes sexués et apomictiques chez Paspalum simplex. Le plan de travail comprend : extractions d’ADN, préparation de bibliothèques et séquençage ONT de plantes tétraploïdes. Ces activités contribueront au WP3, qui vise à analyser la structure et l’évolution des génomes apomictiques et à élucider le contenu en gènes et la fonction du locus d’apomixie. Les autres membres de l’équipe qui participeront à ce travail sont : Dr Lorena Siena (IICAR), Dr Andrea Rubini (IBBR) et BSc Davide Perrone (IBBR). Juan Pablo travaillera également à la construction d’un vecteur RNAi conçu pour réduire l’expression de ORC3, un gène candidat identifié par le groupe du Dr Pupilli comme régulateur du développement de l’albumen dans les graines apomictiques. Cette construction sera utilisée pour générer des plantes de maïs transgéniques afin de valider sa fonction dans le contrôle de l’excès génomique maternel dans l’albumen d’une plante sexuée cultivée. Cette partie du travail sera réalisée en collaboration avec Dra Francesca De Marchis et Dr Michelle Bellucci, de l’IBBR. 

Image: Juan Pablo A. Ortiz (gauche) & Fulvio Pupilli (droite)

Des plantes transgéniques d’Arabidopsis thaliana ont été générées en exprimant des gènes liés à l’apomixie et identifiés chez Eragrostis curvula. Celles-ci expriment plusieurs phénotypes liés à l’apomixie lors de la spécification de la CMM et au cours du development du sac embryonnaire, ainsi que des signes de perte de méthylation de l’ADN. L’objectif de ce travail est de caractériser les marques d’histones les plus pertinentes au cours du développement de l’ovule dans ces lignées transgéniques d’Arabidopsis en utilisant des techniques d’immunomarquage et de microscopie confocale. 

L’objectif de ce détachement était d’initier la caractérisation de lignées mutantes SALK chez Arabidopsis thaliana pour les gènes CHC2 (Clathrin heavy chain 2) et NFD3 (Nuclear fusion defective 3), tous deux précédemment identifiés comme exprimés de manière différentielle dans les génotypes apomictiques et sexués d’Eragrostis curvula. Le génotypage avec des amorces spécifiques a été réalisé et plusieurs des lignées hétérozygotes qui ont été identifiées sont maintenant étudiées. Nous avons également obtenu des plantes mutées par CRISPR-Cas9 pour le gène SPL7 (Squamosa promoter binding like 7). Celles-ci sont en cours de caractérisation. De plus, des hybridations in situ (ISH) ont été réalisées afin de determiner le profil d’expression du gène SPL7  dans les tissus reproducteurs d’individus diploïdes et tétraploïdes chez A. thaliana (ecotype Col0).

L’objectif principal de ce détachement est de poursuivre la caractérisation d’une population en segregation pour l’apomixie chez Eragrostis curvula pour générer une carte de liaison et sélectioner des individus présentants des marqueurs moléculaires similaires mais des modes de reproduction différents (apomictique et sexué) pour de futures analyses transcriptomiques. Pendant ces deux mois, en collaboration avec le groupe de l’UNIPG, je vais phénotyper et caractériser moléculairement des individus de la population de cartographie. Notre objectif est de créer une nouvelle carte consensus pour E. curvula, d’identifier des marqueurs moléculaires liés à l’apoméiose et, finalement, de découvrir des gènes qui pourraient jouer un rôle dans le contrôle de la reproduction apomictique. De plus, je vais aussi contribuer à la production d’un calendrier visant à associer les paramètres morphologiques floraux aux stades de développement de la mégasporogenèse et de la mégagamétogenèse pour différents génotypes apomictiques et sexués chez E. curvula (Task 3.3).

La visite de Samela Draga au laboratoire du Prof. Pessino du 3 novembre 2023 au 18 janvier 2024 apour objectif général de poursuivre le projet initié en mars-juillet 2023 à l’IICAR-CONICET-UNR qui vise à comprendre le rôle du facteur d’épissage BUD13 (un interacteur de TGS1) chez les plantes de Paspalum apomictiques et sexuées. BUD13 présente une expression différentielle dans les fleurs des plantes sexuées et apomictiques chez au moins deux espèces aposporiques, Paspalum notatum et Hypericum perforatum. Il est intéressant de noter que les mutants bud13 d’Arabidopsis sont associés à des défauts du développement embryonnaire précoce. Au cours de sa visite, Samela produira une sonde BUD13 marquée à la digoxigénine, préparera des coupes d’ovaires inclus dans des blocs de paraffine, et effectuera l’analyse ISH. Les observations permettront de déterminer les profils d’expression spatiale de BUD13 dans les organes reproducteurs des génotypes sexuels et apomictiques de Paspalum notatum.

Au cours de son premier détachement à Rosario du 9 novembre au 14 décembre 2023, Fulvio Pupilli a discuté avec Juan Pablo Ortiz, son équipe et Olivier Leblanc les récentes avancées concernant le séquençage Nanopore et l’assemblage de génomes apomictique et sexué chez Paspalum simplex. De plus, les progrès réalisés dans la caractérisation du gène PsARF5 qui est exprimé de manière différentielle entre les tissus du nucelle disséqué par LCM de génotypes apomictiques et sexuels ont été discutés avec JP Ortiz ainsi que les interactions possibles avec PnIAA30, un gène en cours de caractérisation fonctionnelle  à l’IICAR. Une série d’expériences d’hybridation in situ pour PsARF5 a été programmée pour le prochain détachement. Enfin, il a préparé un exposé sur le rôle du gène PsORC3 dans le développement des l’albumens présentant un excès génomique maternel chez P. simplex et un hommage au professeur Camilo Luis Quarin pour le IVe congrès Apomixis, qui se tiendra du 3 au 7 décembre 2023 à Rosario, en Argentine.

Au cours de ce détachement, nous poursuivons le travail sur Paspalum rufum avec Luciana Delgado.  Pour comprendre les interrelations entre l’architecture des primordia de l’ovule et la plasticité du destin cellulaire menant à l’aposporie, nous effectuons une analyse morphométrique cellulaire en 3D des génotypes de P. rufum montrant une expressivité différentielle de l’aposporie. La première étape consiste à construire un atlas 3D de référence du génotype sexué. Après le travail de segmentation, d’étiquetage et d’exportation des données effectué lors des précédents détachements à l’aide du logiciel MorphographX (MGX), nous avons mis en place une analyse quantitative sur un groupe pilote de 11 ovules à des stades successifs couvrant la fenêtre de développement qui nous intéresse. En plus de la quantification du nombre et de la taille des cellules, différents descripteurs de forme, au niveau des cellules et des organes, ont été sélectionnés et calculés à partir des caractéristiques extraites par MGX. Comme les données pilotes comprennent déjà des milliers de cellules à analyser, des scripts personnalisés en R ont été écrits pour compiler, visualiser et analyser statistiquement les données. En outre, les ovules de P. rufum au stade de la méiose ont été disséqués, fixés et nettoyés, afin d’étendre la fenêtre de développement couverte et de maximiser la probabilité de détection de la croissance cellulaire différentielle entre les génotypes sexués et aposporiques.

Paspalum rufum, Luciana Delgado & Daphné Autran

Davide Perrone est en visite à l’IICAR-CONICET pour poursuivre les expériences initiées lors d’un précédent détachement, concernant la transformation de plantes apomictiques et sexuées de Paspalum notatum avec des rapporteurs fluorescents d’auxine et de cytokinine. Le but de ces expériences est de comparer la distribution des hormones dans les ovules de plantes sexuées et apomictiques. De plus, Davide initiera des expériences d’hybridation in situ visant à comparer l’expression du gene AUXIN RESPONSE FACTOR 10 (ARF10) dans les ovules des biotypes sexués et apomictiques de Paspalum notatum. Enfin, en collaboration avec les scientifiques de l’IICAR, il conduira des analyses miR-seq en utilisant les données générées précédemment à Milan.

Photo (de gauche à droite): Augustus Villalba (IBONE), Silvina Pessino (IICAR), Maricel Podio (IICAR) & Davidse Perrone (Univ. Milan)

Francesca De Marchis est une chercheuse du Conseil national de la recherche, CNR- IBBR – Perugia. Pendant son séjour, elle  va collaborer avec Juan Pablo Ortiz (IICAR) et  son expertise en biotechnologie végétale sera mise à profit pour concevoir un vecteur de transformation pour  Paspalum notatum. Certains gènes candidats pour le déclenchement de la parthénogenèse, et identifiés par le groupe de recherche de l’IICAR, seront sélectionnés pour la transformation de plantes par la technologie biolistique dans le but de modifier leur profil d’expression (expression ectopique ou repression).

L’objectif de mon détachement au NIAB est de poursuivre le travail initié avec le groupe du Dr. Caccamo visant l’identification et la caractérisation d’une région génomique et de gènes impliqués dans l’apomixie. Différentes stratégies et de nouvelles experiences ont été discutées. Le travail en cours consiste à séquencer et à assembler le génome du cultivar apomictique Don Walter (Eragrostis curvula). Ce génome a été séquencé au NIAB à l’aide de la plateforme Oxford nanopore avec le protocole de modèle végétal de très haute précision et l’un des étudiants du CERZOS travaille ici à son assemblage. Nous sommes également impliqués dans un projet de transcriptomique utilisant des données RNA-seq obtenues à partir de tissus de pistil de plantes apomictiques et sexuées à trois stades de développement différents. Nous recherchons des gènes différentiellement exprimés entre des plantes ayant des modes de reproduction différents et des stades de développement différents.

Photo: Viviana devant The Eagle à Cambridge (Angleterre)

Dans le cadre de ce détachement, Lorena Siena, de l’IICAR, sera accueillie à l’IRD pendant trois mois. L’objectif principal est de faire progresser la caractérisation fonctionnelle des gènes TGS1 et QGJ au cours du développement reproducteur chez Arabidopsis thaliana. Les activités seront menées en collaboration avec le groupe de l’IRD e viseront, tout d’abord, à explorer le potentiel pour la formation d’embryons parthénogénétiques dans les lignées mutantes tgs1 en utilisant des rapporteurs fluorescents spécifiques de l’embryon et, transmis maternellement ou paternellement. En outre, l’identité cellulaire des mégaspores, supplémentaires et fonctionnelles, observées dans les ovules qgj sera caractérisée de manière approfondie, par exemple en utilisant le rapporteur pWOX2-CENH3-GFP. De plus, nous initierons des expériences visant à identifier les interactions potentielles entre QGJ et TGS1 en déterminant le profil d’expression de QGJ (pQGJ-GUS) dans les ovules tgs1 et, réciproquement, celui de TGS1 (pTGS1:TGS1-GUS) dans les ovules qgj.

Image: Aqueduc de Montpellier (@ Lorena Siena, IICAR)

L’objectif de ce séjour au CERZOS était d’approfondir mes connaissances, mes compétences et mon expérience pratique dans le domaine de l’hybridation in-situ et de la microscopie DIC chez les plantes.

​

Le travail de Samela à l’IICAR a pour objectif principal de contribuer à l’élucidation du rôle dans la transition reproduction sexuée-apomixie de la protéine BUD13, requise pour l’épissage alternatif. En particulier, elle caractérisera BUD13 dans les bases de données transcriptomiques et génomiques de Paspalum notatum et générera des sondes pour leur détection par hybridation in-situ des ARNs. De plus, elle classera les ovules de plantes de Paspalum notatum sexuées et apomictiques en fonction des stades de développement en utilisant la cytoembryologie DIC, les déshydratera dans une série éthanol/xylol et les inclura dans de la paraffine. Lors d’une deuxième visite (octobre-décembre), elle préparera des sections d’ovule pour hybridation avec des sondes d’ARN sens et antisens marquées à la digoxigénine et détectées par réaction colorimétrique (anticorps DIG conjugué à la phosphase alcaline, substrats NBT/BCIP).  Nous espérons obtenir des informations sur l’expression spatiale de ces gènes candidats pour des génotypes apomictiques et sexués.

Samela Draga (droite) & Silivina Pessino (gauche)

Pendant mon détachement à l’Université d’Adélaïde (laboratoire de Matthew Tucker), mon travail se concentrera sur l’élucidation des mécanismes moléculaires déterminant la progression de la lignée germinale femelle chez Arabidopsis thaliana. En particulier, j’essaierai de caractériser les principaux acteurs impliqués dans la dégénérescence des spores et dans la sélection et la différenciation fonctionnelles des mégaspores à la fin de la mégasporogenèse dans l’ovule. Je déterminerai la contribution de l’interaction entre les phytohormones en essayant de sauver les mutants défectueux dans ces processus clés en utilisant des régions régulatrices spécifiques actives dans différents domaines de l’ovule pour piloter spécifiquement l’expression des gènes candidats.

De gauche à droite: Rosanna Petrella, Skippy le Kangourou, Nicola Babolin

Un nouveau séjour à l’IRD du Dr. Juan Pablo A. Ortiz de l’IICAR, effectué dans le cadre d’un détachement MAD pour la caractérisation des génomes apomictiques (WP3), a débuté le 7 mars 2023. Le plan de travail comprend l’extraction d’ADN de plusieurs échantillons de Paspalum spp, destiné au séquençage Illumina pour réaliser des analyses structurelles du génome. La visite est également consacrée à la préparation d’un nouveau manuscrit décrivant le séquençage, l’assemblage avec une résolution au niveau chromosomique et l’annotation d’un génome diploïde de Paspalum notatum. Ce résultat, issu  d’un effort de collaboration entre différents partenaires argentins, italiens et français du projet MAD, constitue une étape clé pour la progression du WP3 car il servira de référence pour caractériser les génomes tétraploïdes et déterminer la structure et l’évolution de la région impliquée dans l’apomixie. Enfin, le programme de l’atelier international sur le séquençage Nanopore et la bioinformatique, organisé par le projet MAD à Rosario, en Argentine, en novembre prochain, sera discuté et décidé au cours de cette visite.

Serres végétales de l’IRD. Juan Pablo A. Ortiz (droite) & Olivier Leblanc (gauche)

L’objectif de ce détachement était d’analyser les gènes qui montrent une expression différentielle entre ovules de plantes sexuées et apomictiques chez l’espèce Eragrostis curvula et, qui sont également présents dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Dans ce but, nous avons étudié le phénotype de mutants d’A. thaliana, disponibles publiquement pour certains de ces gènes, mais aussi celui de nouvelles lignées de mutants transgéniques générées par la stratégie CRISPR-Cas9. De plus, le développement des ovules dans les génotypes apomictiques et sexuels d’E. curvula a été caractérisé à l’aide de la microscopie confocale afin d’approfondir nos connaissances sur les structures et les différences entre les modes de reproduction sexuel et asexué.

De gauche à droite: Marta Mendes, Lucia Colombo, Alejandra Díaz and Cielo Pasten

​

Davide Perrone (Université de Milan, Italie) est accueilli au laboratoire du Prof. Silvina Pessino à IICAR CONICET, Rosario, Argentine, du 3 septembre au 27 novembre 2022. Son travail, mené en collaboration avec le Dr. Carolina Colono (IICAR-CONICET-UNR), vise à utiliser la transformation biolistique pour produire des lignées fluorescentes de Paspalum notatum DR5 (marqueur d’auxine) et TCS (marqueur de cytokinine) avec différents modes de reproduction (sexualité et apomixie aposporique). Ces matériels végétaux seront utiles pour étudier les profils hormonaux à différents stades de développement de l’ovule chez un modèle apomictique bien caractérisé. En outre, Davide contribue à l’étude du rôle du gène ARF10 (AUXIN RESPONSE FACTOR 10) dans le transport de l’auxine dans l’ovule d’Arabidopsis, en effectuant des caractérisations cyto-embryologiques de croisements arf10 x PIN1 et arf10 x DII-Venus obtenus précédemment à l’IICAR-CONICET-UNR. Enfin, il est impliqué dans l’analyse de la connexion fonctionnelle entre ARF10 et TRIMETHYL GUANOSINE SYNTHASE (TGS1), un gène impliqué dans le contrôle de l’aposporie chez Paspalum.

De gauche à droite: Carolina Colono, Silvina Pessino, Davide Perrone

Un nouveau détachement MAD pour initier la caractérisation des génomes apomictiques (WP3) a débuté le 7 juin 2022. À cette occasion, le Dr Juan Pablo A. Ortiz de l’IICAR (CONICET-UNR, Argentine) visitera le laboratoire du Dr Olivier Leblanc à l’IRD (France). Le plan de travail comprend l’annotation d’un assemblage du génome d’un écotype diploïde de bahiagrass Pensacola (Paspalum notatum, var. saurae Parodi), obtenu précédemment dans le cadre d’une collaboration entre des laboratoires français, italiens et d’argentin. Nous avons également l’intention d’identifier et de caractériser les séquences liées au locus contrôlant l’apomixie (ACL) chez une plante tétraploïde. En particulier, nous utiliserons la technologie ONT « adaptive sampling » qui permet le séquençage de régions d’intérêt. Nous espérons donc enrichir notre séquençage avec des lectures spécifiques de la plante apomictique tétraploïde et ensuite assembler l’ACL. Olivier Leblanc, Cédric Mariac et Julie Orjuela (Unité de recherche DIADE), ainsi que Juan Manuel Vega (MAD détaché de l’IICAR) contribueront à ce travail.

Juan Pablo Ortiz (gauche) & Olivier Leblanc (droite)

Dans le cadre de ce détachement, le Dr Luciana Delgado (IICAR) et le Dr Daphné Autran travaillent ensemble pour étudier la communication entre la division, l’expansion et la différenciation cellulaire tout au long du développement reproducteur femelle chez P. rufum, une espèce apomictique. L’objectif global est de construire un atlas 3D du développement précoce de l’ovule. Pendant le séjour, nous établirons les conditions optimales de clarification des ovules de P. rufum et les techniques de coloration de la paroi cellulaire pour obtenir des images 3D à haute résolution. Les images seront segmentées avec MorphoGraphX, classées par stade de développement, et enfin une analyse quantitative des descripteurs cellulaires sera effectuée. Nous pensons que la compréhension de la coordination entre les processus de développement reproductif avec la croissance et la division cellulaire, dans un contexte apomictique, pourrait être éclairante pour comprendre la régulation de l’apomixie.

Daphné Autran (gauche) & Luciana Delgado (droite)

Un nouveau détachement MAD impliquant des chercheurs d’Argentine et d’Italie commence le 9 mai pour un mois ! En effet, le Dr Juan Pablo A. Ortiz de l’IICAR, (CONICET-UNR) est accueuilli au laboratoire du Dr Fulvio Pupilli à l‘Institut des Biosciences et des Bioressources (IBBR-CNR) de Pérugia. Le plan de travail est centré sur l’analyse fonctionnelle de ORC3, un gène qui ségrège comme complètement lié à l’apomixie, au cours de la formation de l’albumen de Paspalum simplex apomicts. En outre, il est également prévu de réaliser l’assemblage du génome de P. simplex en utilisant les long reads générés par la technologie de séquençage Oxford Nanopore. Les membres du groupe du Dr. Pupilli impliqués dans ces projets sont : María Eugenia Cáceres, Andrea Rubini, Francesca De Marchis et Michele Bellucci. A la fin du détachement, nous espérons avoir terminé la rédaction d’un manuscrit sur l’analyse fonctionnelle de PsORC3 et produit un projet d’assemblage du génome de P. simplex.

Fulvio Pupilli (gauche) & Juan Pablo A. Ortiz (droite)

Ce détachement s’intègre aux activités du projet MAD visant à déterminer la nature, l’évolution et le rôle fonctionnel de la région contrôlant l’aposporie (ACR) chez Paspalum notatum (voir objectifs WP3). En utilisant un génome de référence diploïde et un jeu de séquences « long reads» pour des plantes apomictiques, j’utiliserai la méthode “adaptive sampling” proposée par la plateforme ONT pour enrichir le séquençage en lectures longues de l’ACR et ensuite réaliser un assemblage à haute couverture pour une plante apomictique obligatoire et une autre apomictique facultative. Des analyses complémentaires utilisant des méthodes open source pour identifier et qualifier les variations structurelles seront également appliquées.  Ces travaux devraient permettre des approches de génomique structurelle et comparative pour déterminer le contenu génique et la capacité de codage/régulation de l’ACR et, de fournir des indices sur son rôle fonctionnel dans l’émergence de l’apomixie chez Paspalum.